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北儿神外周刊
第23期
儿童低级别胶质瘤(pLGGs)是最常见的儿童脑肿瘤，拥有显著的发病率。当发生于较好的位置，pLGGs可通过单纯手术切除治疗。然而复发肿瘤或当肿瘤生长在不易切除的位置时，则需要其他的治疗措施，通常这些儿童在他们的童年时期都会接受多种不同的治疗。
目前对于这类患者的治疗(通常包括联合化疗方案)有明显的局限性，但其总体生存率却很高。[1]一系列关于化疗方案的前瞻性研究表明，经治疗后仅有35%-45%患儿五年无进展生存，[2]因此大部分患有pLGGs的患儿经治疗后会出现进展并需要进一步治疗。近年来针对pLGGs的基因学研究已取得了长足深入的进步，但如何将这些研究成果与现有的治疗方案结合以得到更好的方案仍然是一个巨大挑战。
在最近一期《神经肿瘤学》中，Poore等人研究并提出了一种新的组合治疗方案，即把一种小分子抑制剂依维莫司引入传统化疗药卡铂骨干中，[3]作者证明了这种组合方法在pLGG模型体内及体外实验中的协同效益，他们还表示这种协同作用的一种生物学基础是通过消耗谷胱甘肽实现的。
学者们选择依维莫司源于他们发现大部分pLGGs病例与分子变化激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关，这些分子改变最常涉及BRAF基因改变，包括KIAA：BRAF融合复制以及BRAFVE变异。[4-6]根据这些研究结果，治疗策略已转向干扰高度活跃的MAPK通路的分子靶向治疗方案。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径的下游信号分子，也可以由MAPK信号激活。
依维莫司是一种一个强效选择性mTOR抑制剂，也是第一种在进展性/复发性低级别儿童胶质瘤患者中进行试验的小分子抑制剂，[7]这些试验证明了其有效性(从肿瘤稳定性或反应性方面),且患者对此种药物耐受性良好。一些新药也被发现可以直接阻断BRAF及MEK（图1）。几种MEK阻滞剂正在被评估研究，且已应用于同时具有KIAA：BRAF融合复制以及BRAFVE变异的患者，包括司美替尼、曲美替尼、MEK、考比替尼。司美替尼具有目前最完整的研究数据，已完成的第二阶段临床试验显示三分之一患者对治疗有所反应，且具有66%±11%的2年无进展生存率。[8] 其余三种药物目前正在进行I期或II期临床试验，且亦即将得到结果。关于BRAFVE抑制剂的研究也在进行，达拉非尼及威罗非尼这两种I类BRAF阻断药正在进行儿童患者II期临床试验，且在伴随BRAFVE变异的pLGGs患者身上取得了令人欣喜的初步结果。[9]然而当应用于KIAA：BRAF融合复制阳性患者时，I类阻断剂却矛盾性的出现了对于MAPK通路的激活并导致了肿瘤的生长。II类BRAF阻断药在临床前期研究中并未出现这种矛盾结果，[10]且目前正在进行I/II期临床研究。目前靶向治疗已显示了较好的初步结果，但长远的疗效尚不明确，另外这几种药物与其他靶向药物或化疗药物联用时的反应亦不明确。
图1.儿童低级别胶质瘤内常存在激活丝裂原蛋白酶通路的基因改变，图中展示了已进行或正在进行的小分子抑制剂研究，红色部分显示的是卡铂联用依维莫司的一种特殊的作用机制
目前一大临床挑战是如何将此类靶向治疗方案融入到现存联合治疗方案中，联用这些靶向治疗方案并不是毫无风险。一方面这类药物的长期毒副作用并不明确；另一方面，抑制共同通路所产生的副作用及联用药物所带来的叠加毒性目前也不明确。靶向抑制剂联合疗法同样面临实践方面的挑战，首先各种药物临床研究阶段不同(例如，第一阶段药物与第二阶段药物)；另外因不同药物生产公司不同，在实验设计方面进行联合用药研究也存在困难。因此，Poore等人在神经肿瘤学提出的这个研究特别引人注目。他们利用了卡铂这种长期使用的众所周知的安全的药物作为主体，卡铂的作用机理与他们所选择的靶向抑制通路不同，所以最大化的减少了重叠毒性的风险；此外，依维莫司作为一种靶向药物，已被证明在所有癌症中都具有良好的抗肿瘤特性，在一些其他肿瘤的治疗中也已证明可安全地与传统化疗方案联用；而且依维莫司作为第一种应用于儿童pLGGs临床试验的靶向抑制剂已证实了其临床有效性。作者表明这些药物多种体外模型中针对特征性pLGG分子改变具有协同作用。
其他挑战依然存在我们还不知道理想的化疗与小分子抑制剂联合用药的时机——用于确诊时改善肿瘤对药物的反应和无进展生存率？还是用于肿瘤复发或单一化疗药物治疗下复发的情况？此外，人们想知道新一代的BRAF和MRK抑制剂何时将会出现？单一用药的长期效果如何？如果有的话，应该什么时候联合用药？与这些新的靶向治疗药联合使用时传统化疗药应该扮演什么角色？这些问题在下一代针对新发和复发pLGG的儿童临床试验中仍有待回答。
基于以上文献介绍，译者将文内所提一篇文献（InhibitionofmTORC1inpediatriclow-gradegliomadepletesglutathioneandtherapeuticallysynergizeswithcarboplatin）研究结果进行了翻译，该研究通过建立pLGG体内体外模型，细致研究了依维莫司联合传统化疗药卡铂后在低级别胶质瘤体内、体外模型中的作用，为日后pLGG患者化疗新方案的研究提供了基础，研究结果如下：
依维莫司可以抑制mTOC1信号通路，抑制低级别儿童星形细胞瘤细胞系
为研究依维莫司在pLGG患者中的作用，本研究采用了来自pLGG患者并包含多种变异的细胞系（图2），且该细胞系伴随MAPK及mTOC1通路激活（图2A）。这些细胞系包括：Res——一种WHOI级毛细胞星形细胞瘤细胞系；Res——WHOII级幼儿弥漫星形细胞瘤细胞系；BT66——一种伴随原癌基因B-Raf（BRAF）—KIAA融合并采用可诱导大T抗原永生化的WHOI毛细胞星形细胞瘤细胞系；（图2B）JHH-NF1-PA1——一种来自I型神经纤维瘤病患者的缺乏NF-1蛋白表达的WHOI级毛细胞星形细胞瘤细胞系（图2C）。本实验JHH-NF1-PA1取自一名视路肿瘤患者的活检组织，该患者经卡铂化疗后肿瘤复发，继而单独使用依维莫司治疗。
图2.依维莫司可抑制细胞系生长。（A）分别在给予0、0.1、1、10nM依维莫司Res、Res、BT66及JHH-NF1-PA1细胞系的磷酸化S6、S6及三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）Westernblot结果。（B）MTS实验研究给予0.1-10nM依维莫司后各细胞系的增殖情况，每种条件均行三次实验。（C）BrdU量化实验，误差线表示±SD。实验在同样条件下重复三次，误差线表示±SD；*P＜0.05，**P＜0.，***P＜0.0，双侧T检验。
经依维莫司治疗6小时，Res和JHH-NF1-PA1细胞系表现出一种剂量依赖性mTOC活动抑制，0.1nM依维莫司可使磷酸化S6蛋白明显减少（50%）；Res、BT66则分别在给予1nM和10nM依维莫司时出现减少（图2A）。Res细胞系呈现出皮摩尔级的生长抑制（P0.0，T检验），BT66细胞系则呈现出纳摩尔级的生长抑制（P0.05，T检验），Res和JHH-NF1-PA1则未表现出明显的生长抑制（图2B）。溴脱氧尿苷掺入实验也发现1nM剂量依维莫司可减少的Res细胞系增长（P=0.）以及10nM可减少BT66的细胞增长（P=0.），Rs和JHH-NF1-PA1未呈现增长抑制（图2C）。这些研究结果与我们先前研究所得出的结果相符，即Res对mTOC1抑制剂敏感而Res不敏感。（图2D）
依维莫司与卡铂对PLGGs细胞系具有协同治疗作用
为了确定卡铂是否与依佛罗利莫司协同作用，我们首先确定25%的抑制浓度(IC25)和半最大抑制浓度(IC50)使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-酰基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基)-2H-四唑(MTS)对每个卡铂细胞系进行检测。Res相对耐药，而Res和BT66对卡铂更加敏感。JHH-NF1-PA1最不敏感，IC50＞μM（图3A,B），而该细胞系来源患者经卡铂治疗后出现复发。Res对卡铂治疗不明感，但1nM依维莫司与10μM卡铂联用时却戏剧性的发现肿瘤生长被抑制（减少69%，P＜0.0）。BT66与Res细胞系在使用低剂量依维莫司联用卡铂时同样出现了生长抑制（Res：52%减少，P=0.，BT66：68%，P＜0.0）（图3A）。利用Bliss独立模型，本研究发现药物剂量存在协同关系（图3A），根据p-S6的IC50近似值，本研究利用秋-塔拉莱协同作用实验分别测定了Res、Res和BT66细胞系中依维莫司的浓度，研究显示在大多数浓度下卡铂与依维莫司都存在协同作（图3B）。低浓度卡铂与依维莫司JHH-NF1-PA1细胞系中并未表现出协同作用（表2A），然而高浓度组中存在协同作用（图3C）。采用溴脱氧尿苷掺入的实验结果与MTS法所得结果一致，且96小时后Res、Res和BT66细胞系扩增呈现下降趋势（P＜0.）（图3B-D）。
图3.在pLGG治疗时，依维莫司与卡铂具有协同效应。（A）MTS法测定培养5天Res、Res、BT66及JHH-NF1-PA1细胞系内的卡铂浓度，卡铂浓度是由之前的IC25单剂量实验测定的。误差线表示±SD；*P＜0.05，**P＜0.，***P＜0.0，ANOVA检测。（B）左：Res分别经DMSO、0.1nM依维莫司、50μM卡铂、联合方案治疗96小时后的X荧光图；右：BrdU(+)细胞定量检测。（C）左：Res分别经DMSO、0.1nM依维莫司、10μM卡铂、联合方案治疗96小时后的X荧光图。右：BrdU(+)细胞定量检测（D）左：BT66分别经DMSO、0.1nM依维莫司、50μM卡铂、联合方案治疗96小时后的X荧光图。4，6-联脒-2-苯基吲哚染色为蓝色，BrdU为红色。右：BrdU(+)细胞定量检测。实验在同样条件下重复三次，误差线表示±SD；*P＜0.05，**P＜0.，***P＜0.0，ANOVA检测。测量误差为50微米。
依维莫司与卡铂在一例PLGG体内模型呈现协同效应
为进一步研究卡铂与依维莫司联合使用能否抑制肿瘤生长，本研究实验性治疗了携带BT40胶质瘤的小鼠，BT40患者来源异种移植系是一种先前描述的含有BRAFVE基因融合的儿童毛细胞星形细胞瘤模型（图2A）。实验动物被分为几组分别给予卡铂50mg/kg/周、5mg/kg依维莫司3次/周、联用卡铂与依维莫斯以及空白对照，联合使用药物组肿瘤生长抑制明显优于任何一种单独治疗组（P＜0.），肿瘤最终生长的体积也明显低于单独治疗组（P＜0.和P＜0.05；图4B）。不论是单独使用依维莫司、卡铂，或是联合用药，实验鼠都没有出现出明显的毒副作用表现。
图4.卡铂合并依维莫司可抑制BRAFVR基因导致的BT40肿瘤生长。（A）卡铂50mg/kgi.p.1次/周(n=17)，5mg/kgp.o.3次/周(n=16)，空白对照(n=9)或联合治疗(n=20)四种方案治疗后肿瘤的改变；肿瘤体积mm3时开始给予治疗，实验第18天处死大鼠，留取肿瘤标本。（B）处死大鼠时肿瘤的体积分布，每个数据点代表一个肿瘤。误差线表示±SD；*P＜0.05，**P＜0.，***P＜0.0，ANOVA检测。（C）肿瘤p-S6、总p-S6、p-Rb（丝氨酸）、总Rb、γ-H2AX及其GAPDH的westernblot结果，测量值利用GAPDH及空白对照标化。
该研究继续分析了依维莫司与卡铂在BT40肿瘤模型体内的下游因子，Western电泳和免疫组化显示相比于卡铂治疗组与对照组，依维莫司治疗组的磷酸化S6表达明显下降（图4C，图5）。为了明确细胞周期的进展，作者探索并研究了磷酸视网膜母细胞瘤蛋白(p-Rb;ser)，发现p-Rb在单独使用依维莫司或联合治疗方案组中相比单独使用卡铂组及对照组明显减少（图4C）。研究还测量了γ-H2AX（一种DNA双链断裂的标记物，常被用作铂类化疗的疗效指标），并通过免疫印迹发现经依维莫司治疗的大鼠相比其他大鼠γ-H2AX明显增多。
依维莫司与卡铂联用可诱导细胞凋亡与DNA破坏
该研究检测了细胞凋亡与DNA破坏标志物以发现协同作用的潜在机制，并发现在联合应用依维莫司和卡铂的Res与Res细胞系中裂解的细胞凋亡蛋白酶-3（CCS-3）染色增加，而这是细胞凋亡的标志之一（Res：增加%，P＜0.；Res：%，P＜0.0）(图5A,B)，而单用依维莫司并不会介导这种细胞凋亡。
该研究同时利用另外一种细胞凋亡标志物，即裂解的聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）与γ-H2AX分析了Res、Res与BT66细胞系在治疗过程中的改变，在所有细胞系中卡铂均可提高裂解的PARP，而依维莫司组却没有，但联合用药时该标记物含量却高于单独使用卡铂（图5C，Res:增加%，Res：增加%，BT66：增加%）。研究同时发现联合用药组γ-H2AX也显著提升，该结果亦优于单独使用卡铂（图5C，Res:增加%，Res：增加%，BT66：增加%）。由于联合治疗后γ-H2AX增加，且单独使用依维莫司是CC3与裂解的PARP并未增加，所以作者推测依维莫司强了卡铂的疗效。
图5.依维莫司与卡铂联用可诱导细胞凋亡与DNA破坏。（A）左：Res分别经DMSO、0.1nM依维莫司、50μM卡铂、联合方案治疗96小时后的X荧光图，4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）与CC3（红色）染色显示凋亡细胞。右：以CC3(+)进行细胞定量检测。（B）Res分别经DMSO、0.1nM依维莫司、μM卡铂、联合方案治疗96小时后的X荧光图，DAPI与CC3染色显示凋亡细胞。右：以CC3(+)进行细胞定量检测。误差线表示±SD；*P＜0.05，**P＜0.，***P＜0.0，ANOVA检测。（C）Res、）Res与BT66经治疗96小时后的γ-HA2X、裂解PARA、磷酸化S6的westernblot结果，标准化定量评估蛋白表达，误差50微米。
依维莫司可降低细胞内谷胱甘肽水平
含铂类药物解毒的关键机制是谷胱甘肽介导的铂类药物活性降低，目前已知mTOC1可产生谷胱甘肽产物，作者推测依维莫司可抑制细胞内谷胱甘肽作用以加强卡铂对DNA的破坏作用。因此为明确此机制，作者检测了经依维莫司治疗后细胞的谷胱甘肽含量。
图6.依维莫司可消耗pLGG内的谷胱甘肽。（A）图表显示了被完整标记的谷胱甘肽分解出同位素标记碳（13C）和氮（15N）过程。（B）同位素标记法分析谷氨酰胺（M+7）与谷氨酸盐（M+6），谷胱甘肽（M+6）含量与依维莫司治疗强烈相关（Res，1nM依维莫司；Res，0.1nM依维莫司）。（C）使用5mg/kg依维莫司治疗BT66与空白组对照细胞内谷氨酰胺、谷氨酸盐及谷胱甘肽含量。
作者采用了稳定同位素标记的谷氨酰胺孵育细胞（13C5，15N2），利用流式细胞检测技术测定细胞内谷氨酰胺含量以确定pLGG细胞系经依维莫司治疗后谷胱甘肽是否被分解。谷氨酰胺是绝大部分细胞内谷氨酸盐的基本前体，如果谷胱甘肽是由被标记的谷氨酰胺（M+7）直接合成，则它会转变为一个含有5个被标记的碳基以及1个被标记的氮基（M+6）的谷氨酸盐（图6A）。这种标记物会持续存在在谷氨酸盐中，因为在接下来的反应中这5个碳基和1个氮基不会被分离出去。作者发现在研究过程中谷氨酰胺（M+7）向谷氨酸盐（M+6）的转化明显减少，这表明依维莫司可以抑制谷氨酰胺酶的作用，在Res和Res细胞系中谷胱甘肽（M+7）减少了大约50%（P＜0.0）（图6B）。
作者同时研究了依维莫司在BT66肿瘤体内模型中的作用机制，并发现研究结果与先前的体外稳定同位素标记研究结果一致。谷氨酰胺仍未改变，然而谷氨酸盐明显减少（35%，P＜0.0），谷胱甘肽也出现减少（42%，P＜0.0）（图6C）。
谷胱甘肽可挽救经依维莫司和卡铂联合治疗的细胞
作者猜测γ-谷氨半胱氨酸合成酶抑制剂丁胱亚磺酰亚胺（BSO）是否也可以取得类似依维莫司的作用，因其可以消耗谷胱甘肽。当使用卡铂联用BSO时大多数pLGG细胞系均呈现更明显的γ-H2AX磷酸化，JHH-NF1-PA1却未出现此现象，（图7A，Res：增加%，Res：增加%，BT66：增加%）。相比于单独用药，经联合用药后Res与Res呈现明显的生长抑制（P＜0.05）。联合用药治疗JHH-NF1-PA1对其生长抑制程度相比单独使用卡铂或BSO无明显差别（图6）。
最后作者希望明确外源谷胱甘肽能否挽救经卡铂与依维莫司治疗的细胞，并发现给予经卡铂、依维莫司治疗的Res细胞系外源性谷胱甘肽后可明显的挽救细胞系（图7B）。溴脱氧尿苷掺入实验也可验证谷胱甘肽可逆转卡铂与依维莫司在Res和Res中的毒副作用（P＜0.01），谷胱甘肽本身在溴脱氧尿苷掺入实验中并不会发生作用（图7C，Res：P=0.99,Res：P=0.90）。谷胱甘肽也可挽救细胞凋亡，相比单独用药组，谷胱甘肽加入联合用药组CC3表达明显提升（P＜0.0）。总的说，依维莫司可减少细胞内谷胱甘肽，并因此提升卡铂的疗效（图7E）。
图7.谷胱甘肽可挽救经依维莫司和卡铂联合治疗的细胞。（A）pLGG肿瘤细胞经卡铂或BSO治疗96小时后，γ-HA2X的westernblot结果，数字代表经GAPDH和空白对照标化后的蛋白扩增定量结果。（B）用DMSO、卡铂联用依维莫司或卡铂、依维莫司内加入4mM谷胱甘肽处理Res细胞后，在×相位对比显微镜，显示联合治疗可诱导细胞凋亡，且细胞凋亡可通过补充谷胱甘肽避免。（C）在使用卡铂、依维莫司和/或谷胱甘肽治疗96小时后，用免疫荧光法定量检测BrdU阳性的Res和Res细胞。（D）治疗96小时后免疫荧光定量检测CC3阳性的Res和Res细胞。条形图表示四分位分布的样本范围，**P＜0.01，****P＜0.0，ANOVA检测。（E）依维莫司通过消耗细胞内谷胱甘肽并加强DNA破坏作用的流程图。
基于以上研究结果，该研究得出以下结论：通过抑制谷胱甘肽对卡铂的解毒作用，依维莫司与卡铂联用可有效增强卡铂对DNA的破坏作用及细胞凋亡作用，进而介导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
References
[1]BandopadhayayP,BergtholdG,LondonWB,etal.Long-termout中国最好的白癜风医院北京治白癜风的医院哪家好
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